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三種紫外吸收法測蛋白質含量

日期:2022-09-16 12:41
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摘要:三種紫外吸收法測蛋白質含量
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下三種紫外吸收法測蛋白質含量。

1. 280nm的光吸收法
因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有**大吸收,且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大,因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是**常用的紫外吸收法。
測定時,將待測蛋白質溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白質溶液的溶劑(水或緩沖液)作空白對照,在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿,盛有濃度為1mg/ml的蛋白質溶液時,a280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質的大致濃度。
許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值(A1%1cm)有文獻數據可查,根據此光吸收值可以較準確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與(A1%1cm)值(即蛋白質溶液濃度為1%,光徑為1cm時的光吸收值)的關系。文獻值A1%1cm,稱為百分吸收系數或比吸收系數。
蛋白質濃度 = (A280′10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度  10mg/ml)
例:牛血清清蛋白 : A1%1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 :   A1%1cm=22.8 (280nm)
若查不到待測蛋白質的A1%1cm值,則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質,用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標準蛋白質為牛血清清蛋白(BSA)。
標準曲線的測定:取6支試管,按下表編號并加入試劑:
管號 1 2 3 4 5 6
BSA(1.0mg/ml) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管為空白對照,各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度A280,以A280為縱座標,各管的蛋白質濃度或蛋白質量(mg)為橫座標作圖,標準曲線應為直線,利用此標準曲線,根據測出的未知樣品的A280值,即可查出未知樣品的蛋白質含量,也可以用2至6管A280值與相應的試管中的蛋白質濃度計算出該蛋白質的A1%1cm,280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對紫外光有很強的吸收,在280nm處的吸收比蛋白質強10倍(每克),但核酸在260nm處的吸收更強,其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數是280nm處的2倍,而蛋白質則相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常:
純蛋白質的光吸收比值:A280/A260  = 1.8
純核酸的光吸收比值: A280/A260 = 0.5
含有核酸的蛋白質溶液,可分別測定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的經驗公式,即可算出蛋白質的濃度。
蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260
此經驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所測定的數據來建立的。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時,可用215nm與225nm吸收值之差,通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。
用已知濃度的標準蛋白質,配制成20~100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質溶液,分別測定215nm和225nm的吸光度值,并計算出吸收差:
吸收差d= A215 -A225
以吸收差d為縱座標,蛋白質濃度為橫座標,繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差,即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。

以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結關于三種紫外吸收法測蛋白質含量。
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