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淺談層析實驗中的氣泡問題(三)

日期:2022-09-16 12:42
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摘要:淺談層析實驗中的氣泡問題(三)
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下淺談層析實驗中的氣泡問題(三):

       說到氣泡,你可能會聯想到酣暢淋漓的可樂,通透上頭的啤酒,亦或是流光飛舞的浪漫,生活中的氣泡,似乎還帶有那么一絲美好,然而對于實驗來說,尤其是在大多不會配置在線脫氣單元的FPLC系統上做的層析實驗,氣泡就如煩人的蒼蠅,鞋里的石子,令人如鯁在喉不吐不快,如若是重要樣品、昂貴填料,氣泡帶來的實驗失敗那簡直是小型災難現場。那么氣泡是源自何來,而又去之何處,怎么能讓它們從我們的系統里消失,以下此篇,做一個小小探討,拋磚引玉,共謀對策而滅之。


關于氣泡來源,正如病從口入,無非就是進入系統的開口處:流動相,或者流路中相對負壓處的漏點;如果流動相脫氣不理想或儀器本身連接管路、組件存在問題,流路中將形成肆意妄為的氣泡,引發一系列問題: 

      1. 組分峰面積變化,峰形變化;
      2. 形成尖峰或鋸齒狀噪聲;
      3. 出現鬼峰 ,基線漂移波動增大;
      4. 泵動作失常,壓力波動,檢測基線全抖;
      5. 填料走空,干柱;
      6. 溶解氧可能氧化樣品組分和(或)流動相及固定相組分,使檢測失真。
實際案例



Fig.1 氣泡造成的UV雜峰

Fig.2 氣泡造成的系統壓力波動


這些癥狀基本能覆蓋大部分的層析實驗問題,可見氣泡的破壞力和惱人程度,知己知彼方才能有的放矢,那么氣泡是如何形成的呢?流動相中氣體形成的原因有多種,*根本的還是由于氣體在液體中達到過飽和狀態;平衡狀態時溶解空氣的量與溶液的性質、氣體的種類有關,也與外界條件有關, 主要的外界條件有以下 3 種。


氣體的溶解量與氣體的種類有關,也與溶劑的種類有關。通常極性低的氣體容易溶解于低極性的溶劑,極性高的氣體容易溶解于高極性的溶劑。通常當兩種不同的溶劑混合時,混合溶劑中溶解的空氣量也將發生變化。大量實驗證明:混合溶劑中溶解的空氣量比各個純溶劑的空氣溶解量要小。
● 配置緩沖液時,大多會進行不同液體的混合,液體熱力學體積的變化,和放熱吸熱,都會產生氣泡,如配置20%乙醇溶液,酸溶液,鹽溶液,乙腈溶液,會明顯有氣泡產生,此時就需要對溶液進行靜置或脫氣操作,才可用于實驗。

● 在層析實驗中,有很多溶液混合的操作,如置換緩沖,洗脫等等,所以一些溶液的混合需要盡量避免,比如乙醇溶液和鹽溶液,需要用純水隔開,否則易造成氣泡析出,所以當乙醇溶液保存的系統需要進行實驗時,緩沖液是鹽溶液如PBS,我們就需要用純水先做系統沖洗,再做PBS的填充。



Fig.4 緩沖液中析出的氣泡

如果實驗設計中,不可避免的需要兩種不同極性溶劑的混合,還要避免氣泡,則需要 從混合處想辦法,一般的層析系統兩相溶劑的混合是在有攪拌裝置的動態混合池中進行,混合劇烈,容易析出氣泡,此時可以考慮將動態混合器改為靜態混合器,讓溶劑的混合方式由劇烈變為溫和,會有較好的避免氣泡的效果。


 Fig.5 動態混合器和靜態混合器

另外,除了溶液帶入,系統中的漏點也會引入氣泡,尤其是未加壓的低壓流路,在管路接頭、閥和轉子等分離結構位置,容易產生漏點,系統中如果發現有氣泡造成基線波動,而在溶液進口又沒發現可見的氣泡,則需要在系統內查找漏點,有效的辦法是用透明的ETFE管代替不透明的Peek管,觀察是哪一段出現的氣泡,以便判斷漏點,及時處理。



Fig.6 管路中漏入的氣泡

關于溶劑的脫氣方法,目前常用的有兩種:超聲脫氣和負壓脫氣;超聲脫氣就是利用超聲鍋或者超聲探頭,當高功率超聲波耦合到液體中時,液體分別在高壓和低壓循環中被壓縮和膨脹,在低壓循環中,會產生微小的真空氣泡(所謂的空化氣泡),這些氣泡會在多個壓力循環中增長。在氣泡生長的那些周期中,液體中的溶解氣體進入真空氣泡,這樣真空氣泡就變成了不斷增長的氣泡。超聲脫氣特點是操作便捷,效率高,脫氣快,一般10-15分鐘的超聲可以去除溶液中大部分氣泡,缺點是容易發熱,需要降溫,注意在用超聲鍋脫氣時,溶劑瓶蓋要擰松或者拿掉;負壓脫氣是利用機械產生負壓的方式使溶液中的氣泡析出,一般分析型色譜儀或者需要高精度檢測的儀器,在流路中配置在線脫氣單元,都是利用負壓的原理進行脫氣,實驗室常用的是真空抽濾裝置,既能過濾溶液,又能脫氣,實用性高。


Fig.7 超聲脫氣


Fig.8 真空抽濾裝置



如果層析系統的流路里混入了氣泡,首先是要進行大流速的system wash,可吹掃出大部分的氣泡,然而有些微小氣泡仍然是不容易沖出的,在可見透明管中的細微氣泡可用外力敲打讓其脫離管路內壁而沖出,但是系統內部,尤其是泵腔,單向閥,檢測器流通池內的細微氣泡,不可視,也不能外力敲打,所以無法判斷是否沖洗徹底,滯留在柱塞泵單向閥或者檢測器流通池的微小氣泡仍然會給層析圖譜帶來波動影響,此時我們可以使用無水甲醇或乙醇來做system wash,*好加一定的反壓,因為甲醇或乙醇試劑降低了氣-液界面張力,甲醇(乙醇)分子不能形成堅固的膜,于是氣泡破裂或者從流路內壁脫落,從而帶出了流路中的各種細微氣泡,達到系統脫氣的目的;而另一方面,系統內部流路的清潔程度也是影響氣泡滯留的重要原因,FPLC系統經常會過復雜的生物質樣品,如果日常沖洗不充分,流路內壁容易形成臟污,會增加對微小氣泡的頑固吸附,影響實驗,因此定期的系統全*面清洗,對于排除氣泡也是至關重要

總而言之,對于快速制備型色譜層析,氣泡固然是一個人人喊打的不穩定因素,但我們如果了解原因,準備充分,方法得當,氣泡也是可以從系統中徹底趕走,讓實驗更加流暢,讓圖譜更加平滑,讓珍貴樣品上乘分離,讓昂貴填料物盡其用。



以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結關于淺談層析實驗中的氣泡問題(三)。
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